溶血性贫血实验室检查(1).ppt

根据病因和发病机制的贫血分类 一、红细胞生成不足 （一）造血干细胞复制和分化异常 再生障碍性贫血 异常细胞或组织骨髓浸润 骨髓病性贫血 原因不明或多种机制慢性系统性疾病（慢性感染、炎症、恶性肿 瘤、慢性肾病、肝病、风湿性疾病、内分泌病等）伴发的贫血 （二）细胞分化和成熟障碍 DNA合成障碍 叶酸及（或）维生素 B12缺乏所致巨幼细胞贫血 血红蛋白合成障碍 缺铁性贫血、铁粒幼细胞性贫血 珠蛋白合成缺陷 珠蛋白生成障碍性贫血（海洋贫） 二、红细胞破坏过多 红细胞内在缺陷（遗传性缺陷）红细胞外来因素（获得性因素） 三、失血 急性失血 急性失血后贫血 慢性失血 同缺铁性贫血 溶血性贫血 的实验室检查 n 什么叫溶血性贫血 hemolytic anemia----指各种原因导 致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加 速，骨髓代偿造血功能不足时所发生的 一类贫血。 n 什么叫溶血性疾病 指骨髓代偿能力尚足以补偿红细胞 的损耗而不出现贫血。 溶血性贫血的分类 病因和发病机制 1、 RBC内在缺陷所致的溶贫 （ 1） RBC膜缺陷 遗传球 PNH （ 2） HB结构异常 海洋性贫血 （ 3） RBC内酶缺陷 G-6PD缺乏症 2、 RBC外来因素所致的溶贫 AIHA、 药物、化学因素、感染因素 溶血性贫血的分类（溶血的场所） 1、 血管内溶血 RBC在循环血液中直接破坏， 如 血型不合输血 PNH 2、 血管外溶血 RBC在脾脏破坏，如 球形 RBC 增多症、脾亢 3、 原位溶血幼 RBC在骨髓中溶血，如 AL、 巨 幼贫 如何诊断溶血性贫血 第一步 确定是否有溶血 第二步 哪一类溶贫 一、首先确定有无溶血 （一） 找出 RBC破坏增多的依据 （ 1） RBC寿命缩短 （ 2）血片见 RBC碎片 （ 3） 血浆游离 HB增高 （血管内溶血） （ 4） HB尿检测（＋），酱油色 （ 5） 尿含铁血黄素试验（＋） （ 6）血清非结合胆红素（间接胆红素）增高 （ 7）尿胆原增高 （ 8） 血清结合珠蛋白减低 （ 9） 血浆高铁血红素清蛋白检测（＋）电泳法 区带 Hb代谢示意图 珠蛋白 血红素 铁 卟啉 单核巨噬系统 脾脏 血管外溶血 RBC 血管内溶血 血浆游离 Hb 肾脏 血红蛋白尿 游离胆红素 肝脏 结合珠蛋白 近曲小管上皮细胞 肾阈 结合胆红素 粪胆原的肠肝循环 含铁血黄素尿 Rous 实验 胆汁 粪胆原 肠道 血液 肾脏 尿胆原高铁血红蛋白 清蛋白 /血红素蛋白 溶血性贫血筛查 n 红细胞寿命测定 n 方法 51Cr标记红细胞，检测其半衰期 n 正常红细胞半衰期 2532天 n 溶血性贫血者半衰期小于 15天 n 确定溶血性贫血的可靠方法 溶血性贫血筛查 n 血浆游离血红蛋白测定 n 参考值 ＜ 50mg/L1-5mg/dl n 临床意义 n 血管内溶血者明显升高 n AIHA、珠蛋白生成障碍性贫血者轻度升高 n 血管外溶血时正常 溶血性贫血筛查 n 血清结合珠蛋白测定 n 参考值 0.7-1.5g/L n 临床意义 n 各种溶血均可减低，血管内溶血减低最显著 n 肝病、传单、先天性无结合珠蛋白血症减少或消失 n 感染、创伤、糖皮质激素治疗、服用避孕药物、肝 外阻塞性黄疸可增高 溶血性贫血筛查 n 血浆高铁血红素清蛋白测定 n 方法 n 生化法与硫化铵形成铵血色原，经光谱仪测定 558nm吸收光带 n 电泳法醋酸纤维膜电泳 n 正常值阴性 n 临床意义阳性者表示严重的血管内溶血 溶血性贫血筛查 n 含铁血黄素尿试验（ Rous试验） n 原理 n 铁离子 氰化钾 铁氰化铁（蓝色） n 如肾小管上皮有含铁血黄素，该试验阳性 n 正常值阴性 n 临床意义阳性者表示慢性血管内溶血，如 PNH 含铁血黄素 （ 二）显示红细胞代偿增生依据 n 外周血网织红增多； n 外周血红细胞形态 大小不均，大红细胞、嗜多色细胞及有核红细胞， Howell-Jolly小体、 Cabot环、点彩红细胞等 n 增生性贫血骨髓象 增生明显活跃，红系显著增生，粒系相对减少，巨 核系一般正常 二、哪一类溶血性贫血 （一）红细胞膜缺陷的检验 n 红细胞渗透脆性试验 n 红细胞孵育渗透脆性试验 n 自身溶血试验及纠正试验 1、 红细胞渗透脆性试验 原理 n 正常红细胞为双凹圆盘状 ,在低渗盐水中吸水膨胀的 适应性较大 可增加 70的体积而不破裂 n 遗传性球形细胞增多症等红细胞的表面积 /体积 S/V的比值小 ,对低渗盐水的适应性小 脆性增大 n 本试验是测定红细胞在一系列不同浓度低渗氯化钠 盐水内开始溶血和完全溶血的氯化钠浓度，检测其 对不同浓度的低渗盐水溶血的抵抗力。 红细胞渗透脆性试验 （ erythrocyte osmotic fragility test 原理 低渗溶液 红细胞皱缩 红细胞膨胀 甚至破裂 高渗溶液 等渗溶液 正常 低渗溶液 参考值 0.6 - 0.8NaCl溶液 红细胞不破裂 0.42-0.46NaCl溶液 部分红细胞破裂 0.28-0.34NaCl溶液 红细胞完全破裂 NaCl 0.85 0.6 0.42 0.340.8 0.7 对低渗溶液抵抗能力 减小 即 RBC渗透脆性 增加 n 临床意义 （ 1）脆性增高 n 开始溶血及完全溶血时氯化钠浓度较正常 对照提前两管，即 0.04以上 ;开始溶血 ＞ 0.5，完全溶血＞ 0.38 n 主要见于遗传性球形红细胞增多症 （ 2）脆性减低 n 小细胞低色素性贫血海洋性贫血、缺铁 性贫血 2、红细胞孵育渗透脆性试验 原理 37℃ 孵育 24小时，细胞内葡萄糖消耗增加， ATP 减少，钠离子泵出减少，细胞膨胀，脆性增高 。 参考值 未孵育 50 溶血 44.45g/LNaCl 孵育 50 溶血 4.655.9g/LNaCL 临床意义 常用于轻型遗传球、遗传性非球形 细胞溶血的诊断 n 脆性增高 遗传性球形红细胞增多症 n 脆性减低 缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、 镰形细胞贫血、脾切除术后 3、自身溶血试验及纠正试验 原理 n 先天性非球形红细胞溶血患者红细胞内酶缺陷，葡萄糖 酵解障碍， ATP不足不能维持细胞钠泵作用 n 患者红细胞在自身血浆中孵育 48h，溶血增强，可加入 葡萄糖、 ATP，观察溶血能否被纠正 参考值 n 正常人 孵育后轻微溶血、溶血度＜ 3.5 n 加葡萄糖和加 ATP后，溶血明显纠正，溶血度＜ 1 3、自身溶血试验及纠正试验 临床意义 常用于遗传球、遗传性非球形细胞 溶血的鉴别诊断 ￿￿ 性球形 ￿ 胞增多症 ￿￿ 性非球形 ￿ 胞性溶 ￿ （ Ⅰ 型）葡萄糖 6 磷酸脱 ￿ 酶 缺陷症 （ Ⅱ 型）丙 ￿ 酸 激 酶 缺陷症 孵育后溶血 增 强 增 强 增 强 加葡萄糖后溶血 明 ￿￿ 正 部分 ￿ 正 不能 ￿ 正 加 ATP后溶血 明 ￿￿ 正 部分 ￿ 正 ￿ 正 （二）红细胞酶缺陷的检验 n 定义红细胞酶缺陷所致溶血性贫血又称红细胞 酶病，指参与红细胞代谢的酶由于基因缺陷，导 致活性改变而发生溶血的一组疾病 n 内容 n 高铁血红蛋白还原试验 n 氰化物 -抗坏血酸试验 n 变性珠蛋白小体生成试验 n 葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定 n 丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定 n 原理 1、高铁血红蛋白还原试验 G6PD正常 nNADPH还原型辅酶 Ⅱ n烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 高铁血红蛋白 亚铁血红蛋白 NADPH充足 G6PD 高铁 Hb还原酶 G6P G6-PA NADP NADPH 还原型美兰 氧化型美兰 高铁 Hb（ Fe3）为褐色 氧合 HB（ Fe2）红色 结果 光电比色法 ，正常还原率＞ 75 ，低于 75 为异常， 提示 G6PD活力 ↓， 74 ～ 31 为 G-6PD缺乏的杂合子（红棕 色）， 30 以下为显著缺陷的纯合子（为棕色 目测比色法）。 n 参考值 n 高铁血红蛋白还原率 ＞ 75 n 高铁血红蛋白 0.31.3g/L n 临床意义 n G6PD缺陷导致高铁血红蛋白还原率下降 n 见于蚕豆病、伯氨喹型药物溶血性贫血 1、高铁血红蛋白还原试验 原理 6-磷酸葡萄糖 NADP GSH H202 氧合血红蛋白 6-磷酸葡萄糖酸 NADPH GSSG H20 高铁血红蛋白 结果 正常人标本呈红色 G-6PD 2、氰化物 -抗坏血酸试验 临床意义 n 正常血液数小时后变成暗色 n 纯合子 G6PD缺乏者 2h变色 n 杂合子 G6PD缺乏者 34h变色 3、变性珠蛋白小体生成试验 n 又称 “红细胞包涵体 ”、 “赫恩小体 ”、 “Heinz 小体 ”、 “海因小体 ” n 原理 G-6PD缺乏致红细胞内 GSH减少，高铁 血红蛋白增高，形成变性珠蛋白小体，沉着于 红细胞膜上。 抗凝血 乙酰苯肼 37℃ 温育 2～ 4h 充分的氧化 其 Hb氧化成 Heinz小 体（用结晶紫、甲紫 或煌焦油兰染色，油 镜观察） n 1. 正常人 ＜ 30 n 2. G6PD缺陷症 、不稳定 Hb、 HbH病等常高于 45 结果 该小体为圆形或多角形 色涵体， φ0.2～ 2um。 多位于红细 胞边缘，一个红细胞含 1～ 20个， 多为 1～ 2个，以含 5个以上小体的 红细胞计数 4、 G6PD荧光斑点试验和活性测定 原理 G6PD 使 NADP还原成 NADPH, 后者在紫外线 照射下发出荧光 参考值 正常人强荧光； 酶活性 5 U/gHb 6-磷酸葡萄糖 NADP GSH H202 氧合血红蛋 白 6-磷酸葡萄糖酸 NADPH GSSG H20 高铁血红蛋白 G-6PD 5、丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定 原理 ADP PK 磷酸丙酮酸 丙酮酸 NAPH 乳酸 NAD（无荧光） n 参考值 n 正常 PK活性荧光在 20min内消失 n 酶活性 15.1±4.99U/gHb n 临床意义 n PK严重缺乏（纯合子）荧光 60min不消失 n 杂合子荧光 2560min消失 三 、珠蛋白合成异常的检测 n 血红蛋白的结构 原卟啉 血红素 Hb（ 四聚体） 铁 2条 α 链 珠蛋白由 4条多肽链组成 2条非 α 链 正常人 HbA（ 22） 97 HbA2（ 22） 1.5-3 HbF（ 2 2） 0.5-0.8 血红蛋白病 珠蛋白肽链量的不正常 地中海贫血 血红蛋白分子结构异常 异常血红蛋白病 遗传性溶血性疾病 1.血红蛋白电泳 蛋白质的两性性质 是由氨基酸的 NH与 COO- 决定的。 等电点 调节水溶液的 pH，能使蛋白质的 NH与 COO- 数目相等呈电中性， 此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。 Ø 电泳 一个带电荷的离子或胶体颗粒在电场中可向一极移动。 Ø 原理 在一定的 pH缓冲液中，缓冲液的 pH大于 Hb等电点，其带负电，在电 场中向阳极移动；反之向阴极移动。 由于各种 Hb珠蛋白肽链结构不同，其等电 点不同，电泳方向和速度亦不同，故可分离出不同的区带，对区带进行电泳扫 描，可进行 Hb定量分析。 H J K A G D E - 1. HbH增多是 HbH病，为 α-地中海贫血的一种； HbA2明显增 高见于轻型 β地中海贫血； HbF 明显增高见于中重型 β地中海 贫血。 2. 正常值醋纤法（ PH8.6） HbA 9698 ， HbA2 1.03.1 ， HbF＜ 2 电 泳 结 果 CAA2FA 异常 正常 2.胎儿蛋白 HbF （ 2 2）酸洗脱试 验 含 HbF红细胞着色 原理 n HbF抗酸力强 临床意义 n 脐带血、新生儿、婴儿阳性 n 成人小于 1 n 地中海贫血轻者少数红细胞阳性 n 地中海贫血重症阳性细胞增多 3.HbF定量测定（碱变性试验） 原理 n 碱性溶液中 HbF不易变性沉淀，可测定滤液 中 Hb量 临床意义 n 2岁 -成人 HbF4为异常 n 重型 地贫 80-90 n AL、 AA、淋巴瘤等可轻度升高 4.HbA2定量测定 诊断轻型 地贫的重要依据 5.限制性内切酶谱分析 基因诊断 四 、自身免疫性溶血性贫血检测 自身免疫性溶血性贫血 （ autoimmune hemolytic anemia,AIHA 定义 体内免疫异常，产生自身抗体、补体，结合在红细 胞膜上使红细胞破坏加速 病因 尚未完全阐明，可能因素病毒感染可激活多克隆 B细胞或化学物与红细胞膜相结合，改变其抗原性，导致 自身抗体产生 分类 可为原发性的，也可继发于结缔组织病、造血系统肿瘤 、感染等 按抗体反应最适温度分为温抗体型和冷抗体型，后者又 分为冷凝集素综合征和阵发性冷性血红蛋白尿 1. Coombs试验（抗人球蛋白试验） 原理 不完全抗体 IgG，无法架接两个邻近的红细胞，而只 能和一个红细胞抗原相结合。 抗人球蛋白抗体是完全抗体 ,可与多个不完全抗体的 Fc 段相结合 ,导致红细胞凝集现象 ,称为抗人球蛋白试验阳性。 目的 检查红细胞表面的或血清中游离的不完全 抗体，用于诊断 AIHA。 n 直接 Coombs Test说明病人 RBC表面上包被有不完全抗体 n 间接 Coombs Test则说明病人血清中存在着不完全抗体 Coombs 血 清 （抗 人球蛋白 血 清 ） （ 1）直接试验 １．正常人阴性 ２．直接反应阳性，最常见于 AIHA（其他有药物诱 发的溶贫、阵发性冷性 Hb尿、新生儿同种免疫溶 血病、 SLE、类风湿关节炎、恶性淋巴瘤等）。 目的 测定吸附于红细胞表面的不完全抗体 方法 结果 （ 2）间接试验 有过剩抗体时直接、间接均为阳性。 AIHA分三型 C3型 12， IgG型 24， IgGC3型 60。冷凝集素病为 IgM抗体。 目的 测定血清中游离的不完全抗体 方法 结果 间接阳性，见于 AIHA，正常人为阴性 。 病人血 清 正常 RBC 抗 IgG 2.冷凝集素试验 n 原理 n 冷凝激素是可逆性抗体低温时可与自身红 细胞、 O型红细胞、患者同型红细胞发生凝 集，温度升高时，凝集块又复消失 n 参考值 n 效价低于 140，反应最高温度 4℃ n 临床意义 n 某些 AIHA很高 3. 冷热双相溶血试验 原理 n 阵发性寒冷性血红蛋白尿症（ PCH）患者的血 清中有双相溶血素，在 0-4C时，溶血素与红 细胞结合，并吸附补体，但不溶血；当升温至 30-37C则发生溶血 参考值 阴性 临床意义 阳性见于阵发性寒冷性血红蛋白尿患者 （五）、阵发性睡眠性血红蛋白尿 paroxysmal noturnal hemoglobinuria , PNH 为获得性红细胞膜缺陷引起的慢性血管内溶血 常在睡眠时加重 也可伴有发作性睡眠性血红蛋白尿和全血细胞减少 1、酸溶血试验 Ham试验 原理 PNH患者红细胞膜对补体敏感 ,在酸性 pH6.4～ 6.5条件下 , 能被正常人新鲜血清 含 补体 所溶解 ,产生酸溶血现象。 临床意义 正常人阴性 阵发性睡眠性血红蛋白尿阳性（ PNH），此试验 可作为 PNH的确 诊试验。 2.蔗糖溶血试验 （ sucrose hemolysis test 原理 n 蔗糖溶液加强补体与红细胞结合，使蔗糖进入红细胞 ，导致溶血增强 临床意义 n 敏感性最高，特异性差 n 是 PNH的筛选试验 n 阴性常可排除 PNH，阳性需再做 Ham 试验。阳性率 90 -91 。 3.蛇毒因子溶血试验 原理 n 蛇毒因子直接激活补体 C3，旁路途径激活补 体系统，攻击 PNH病人红细胞 临床意义 n 是特异性 PNH试验，敏感性优于 Ham试验 常用的溶血性贫血病因实验检查项目 ￿ 目 ￿ 果 常 ￿ 疾病 ￿￿ 胞脆性 ￿￿ 增高 ￿￿ 性球形 ￿￿ 胞增多症 抗人球蛋白 ￿￿ 阳性 AIHA； ￿ 物免疫性溶血性 ￿ 血；新生 儿同种免疫容血病；冷凝集素 ￿ 合症 酸 溶血 ￿￿ 阳性 PNH（ 确 ￿￿￿ ） 蔗糖溶血 ￿￿ 阳性 PNH（ ￿￿￿￿ ） 高 ￿ 血 ￿ 蛋白 ￿ 原 ￿￿ ￿ 原率减低 G6PD缺乏症 血 ￿ 蛋白 ￿ 泳 异常 用于 ￿￿ HbC、 HbBart’S等 ￿ 目 ￿ 果 常 ￿ 疾病 HbA2 增高 地 ￿ HbF 增高 地 ￿ 冷 ￿ 溶血 ￿￿ 阳性 PCH 病